Western Blotting ou Immunoblotting é uma técnica que permite estudar a distribuição e o comportamento de proteínas em extratos preparados a partir de tecidos ou células, com base na detecção por anticorpos específicos.

Como funciona?

Pela técnica de Western Blotting são identificadas proteínas específicas que foram previamente separadas umas das outras de acordo com seu tamanho (peso molecular – eletroforese 1D SDS-PAGE) ou/e ponto isoelétrico (eletroforese SDS-PAGE 2D) por eletroforese em gel. A técnica envolve várias etapas que variam de acordo com a amostra, localização da proteína, solubilidade, etc.

Preparação de amostra

Tampões de lise

Para preparar uma amostra para correr em um gel, células e tecidos devem ser lisados para liberar a proteína de interesse. A lise pode ser realizada através de métodos mecânicos (ou seja, sonicação) ou enzimáticos. Isso também solubilizará a proteína, permitindo que migrem individualmente e se separem através de um gel por eletroforese. Há uma variedade de receitas para tampão de lise que diferem de acordo com as proteínas e anticorpos específicos. A maior parte dos tampões de lise contém agentes desnaturantes e redutores, como dodecil sulfato de sódio (SDS) e outros detergentes iônicos. A maioria dos anticorpos reconhecerá proteínas em sua forma desnaturada, porém, é importante observar que nem todos os anticorpos reconhecerão proteínas desnaturadas, portanto detergentes desnaturantes devem ser evitados neste caso.

Exemplos de tampões:

Localização da proteína	Tampão
Célula inteira	NP-40 ou RIPA ou Tris-HCl
Citoplasmática (solúvel)	Tris-HCl
Citoplasmática (ligada ao citoesqueleto)	Tris-Triton
Ligada à membrana	NP-40 or RIPA or Tris-Triton
Nuclear	RIPA ou protocolo de fração nuclear*
Mitocôndria	RIPA ou protocolo de fração mictocondrial *

*As proteínas que podem ser encontradas na localização subcelular podem ser enriquecidas no lisado da fração subcelular usando protocolos específicos. Isso pode ser útil ao tentar obter um sinal de uma proteína fracamente expressa.

Inibidor de Protease e Fosfatase

Após a lise, inicia-se a fosforilação e a desnaturação, portanto é fundamental, para retardar esses eventos, manter as amostras a 4oC o tempo todo e adicionar os inibidores apropriados aos tampões de lise.

Exemplos de Inibidores:

Inibidor	Protease/fosfatase inibida	Concentração final em tampão de lise	Estoque (armazenar a -20oC)
Aprotinina	Tripsina, quimotripsina, plasmina	2 mg/ml	Diluído em H2O, 10mg/ml
Leupeptina	Lisossomal	5-10 mg/ml	Diluído em H2O
Peptistatina A	Proteases aspásticas	1 mg/ml	Diluído em metanol 1mM
PMSF	Serina, cisteína, proteases	1 mM	Diluído em etanol
EDTA	Metaloproteases que requerem Mg2+ e Mn2+	5 mM	Diluir em dH2O, 0,5 M, ajustar para pH 8
EGTA	Metaloproteases que requerem Ca2+	1 mM	Diluir em dH2O, 0,5 M, ajustar para pH 8
NA Fluoreto	Fosfatases de serina/treonina	5-10 mM	Diluído em H2O
Ortovanadato	Tirosina fosfatases	1 mM	Diluído em H2O

Preparação de lisado

Protocolos específicos devem ser usados de acordo com o tipo de amostra (ou seja, tecidos, cultura de células, bactérias) e a proteína de interesse, porém todas as etapas devem ser realizadas a 4oC. Uma vez obtidas as frações de proteínas necessárias, elas devem ser armazenadas a -20oC por um período de tempo curto ou -80oC em ultrafreezers, por um período mais longo.

Quantificação das proteínas

As proteínas podem ser quantificadas usando vários métodos. Os mais comuns são o ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry ou o ensaio de BCA. Normalmente, o padrão proteico frequentemente utilizado para determinar a curva padrão é a BSA (albumina sérica bovina).
Alternativamente, a concentração de proteínas pode ser medida diretamente usando um espectrofotômetro em absorbância de 280 nm. Este método é muito rápido e não requer nenhum padrão, pois a relação entre a absorbância e a concentração de proteína é linear. No entanto, eles podem produzir um erro considerável na concentração de proteínas porque os componentes não proteicos que absorvem a luz ultravioleta irão interferir, portanto, não é recomendado quando é necessária uma quantificação mais precisa.

Preparação da amostra para carregamento no gel

Amostras desnaturadas e reduzidas

Os anticorpos geralmente reconhecem uma pequena porção da proteína específica e esse domínio pode residir na conformação 3D da proteína. Portanto, para permitir esse acesso, a proteína deve ser desdobrada (desnaturada).
Geralmente, para desnaturar as proteínas, um tampão de carregamento (tampão Laemmli) contendo o detergente desnaturante aniônico (SDS) é adicionado à amostra.
O tampão Laemmli contém os seguintes produtos químicos cada um com função específica:
O SDS desnatura a proteína ligando-se ao seu esqueleto polipeptídico, conferindo uma carga negativa ao polipeptídeo que é proporcional ao seu comprimento. Portanto, a migração das proteínas no SDS-PAGE desnaturante é determinada pelo peso molecular.
A adição de 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) é importante para reduzir as pontes de dissulfeto nas proteínas antes que elas adotem a configuração random-coil, necessária para a separação por tamanho.
O glicerol é adicionado para aumentar a densidade da amostra e, portanto, para manter a amostra no fundo do poço após o carregamento.
O azul de bromofenol é um corante aniônico comumente incluído para permitir a visualização da migração da proteína. Como o corante é muito pequeno, ele migrará mais rapidamente do que qualquer componente da mistura a ser separada e fornecerá indicação e monitoramento do progresso da separação. Geralmente, a execução deve ser interrompida quando o corante atingir o fundo do gel.
A mistura é então fervida a 95-100oC por 5 minutos e então carregada no gel.
Se as amostras forem armazenadas para reutilização futura, elas não devem ser fervidas novamente, elas podem ser carregadas diretamente.


Amostras não desnaturadas e não reduzidas

Alguns anticorpos podem reconhecer um epítopo de aminoácidos não contíguos. Embora os aminoácidos do epítopo estejam separados na sequência primária, eles estão próximos uns dos outros na estrutura tridimensional dobrada da proteína. Neste caso, o anticorpo reconhecerá apenas o epítopo existente na superfície da estrutura dobrada.
Na maioria dessas circunstâncias, executar um Western Blot em condições não desnaturantes significa simplesmente deixar o SDS fora da amostra e do tampão de migração e não aquecer a amostra.
Às vezes, certos anticorpos só reconhecem a proteína em sua forma não reduzida, portanto, neste caso, os agentes redutores 2-mercaptoetenol ou DTT devem ser deixados de fora do tampão de carregamento e do tampão de migração.


Eletroforese

A eletroforese pode ser realizada em cuba de eletroforese vertical Cleaver Scientific e pode ser unidimensional (de acordo com o peso molecular das proteínas) ou bidimensional de acordo com o ponto isoelétrico da proteína e o peso molecular). A eletroforese dimensional 1D é geralmente usada para a maioria das separações de proteínas de rotina. Separação dimensional 2D quando for necessário trabalhar toda a proteína presente na célula ou talvez se duas proteínas de interesse tiverem o mesmo peso molecular.
Preparação de géis 1D

Os géis de poliacrilamida são formados a partir da polimerização da acrilamida e da N,N-metilenobis-acrilamida (Bis-acrilamida). A polimerização começa quando o persulfato de amônio e o TEMED são adicionados. Os géis são redes tridimensionais neutras e hidrofílicas de hidrocarbonetos longos reticulados por grupos metileno.
A separação das proteínas depende do tamanho relativo dos poros formados dentro do gel. O tamanho do poro depende da quantidade total de acrilamida presente e da quantidade N,N-metilenobis-acrilamida. À medida que a quantidade de acrilamida aumenta, o tamanho dos poros diminui. Portanto, para separar proteínas de alto peso molecular, é melhor usar géis de baixa porcentagem, como 8%, enquanto para separação de proteínas de baixo peso molecular, o gel de 15% pode ser melhor.

Controle positivo

Um lisado de controle positivo é usado para demonstrar que o Western blot foi realizado corretamente e que o anticorpo reconhece a proteína alvo, que pode não estar presente na amostra experimental.


Marcador de peso molecular

Marcadores de peso molecular como o Class Five Prestained Multicolor Protein Ladder permitirão a determinação do tamanho da proteína alvo por comparação. Marcadores moleculares pré-corados são úteis para monitorar o progresso da separação de proteínas durante a eletroforese e para indicar se a transferência para a membrana (blot) foi ou não bem-sucedida.


Carregamento das amostras no gel

Para carregar a amostra no poço, podem ser usadas ponteiras especiais de carregamento de gel ou uma microseringa. Deve-se tomar cuidado para não tocar o fundo do poço com a ponteira, pois isso criará bandas distorcidas. Nunca encha demais o poço para as amostras não derramarem no poço adjacente.
Geralmente, 20-40 mg de proteínas totais são carregados por poço.
O gel será submerso em em tampão de corrida 1x Tris-glycine (outros tampões podem ser usados de acordo com as necessidades específicas) e a eletroforese prosseguirá até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo do gel. O tempo de corrida irá variar de acordo com a porcentagem do gel e a voltagem utilizada. A corrida poderá ser executada em corrente de até 30mA/gel.
Assim que a corrida terminar, as proteínas começarão a eluir lentamente do gel, portanto, não armazene o gel e prossiga imediatamente para a transferência.


Uso de controles

Para verificar se o poço foi carregado uniformemente com amostra, controles devem ser usados, especialmente quando for analisar uma diferença de expressão de uma proteína em amostras diferentes. Eles também são úteis para verificar se essa transferência foi uniforme em todo o gel. Além disso, eles podem ser usados para quantificar a quantidade de proteína em cada poço, caso não tenha ocorrido carga ou transferência.

Abaixo estão alguns exemplos de controles usados em células de mamíferos.

Controle	Tipo de amostra	Peso molecular (KDa)	Precaução
Beta actina	Célula inteira/citoplasmática	43	Não é adequado para amostra de músculo. Mudanças nas condições de crescimento celular e interações com componentes da matriz extracelular podem alterar a síntese da proteína actina (Farmer at al. 1983)
GAPDH	Célula inteira/citoplasmática	30-40	Alguns fatores fisiológicos, como hipóxia e diabetes, aumentam a expressão de GAPDH em determinado tipo celular.
Tubulina	Célula inteira/citoplasmática	55	A expressão da tubulina pode variar de acordo com a resistência a drogas antimicrobianas e antimitóticas (Sangrajrang et al. 1998; Prasad et al. 2000)
VDCA1/porina	Mitocondrial	31
COXIV	Mitocondrial	16	Muitas proteínas correm no mesmo tamanho que o COXIV.
Laminina B1	Nuclear	66	Não é adequado para amostra em que o envelope nuclear é removido.
Proteína de ligação a TATA TBP	Nuclear	38	Não é adequado para amostra onde o DNA é removido.

Transferência de proteína e coloração

Visualização de proteínas em géis


A visualização do gel pode dar uma indicação se as proteínas migraram uniformemente. Se você planeja transferir a proteína separada para uma membrana, use a coloração de cobre. A coloração de Coomassie não é reversível (NUNCA USE SE VOCÊ PLANEJA SECAR O GEL).

Coloração de Coomassie

A coloração com Coomassie nano protein pode ser usada se você quiser apenas visualizar a proteína no gel ou metade das amostras no gel para posterior comparação com as amostras transferidas como imagem espelhada.
Como já mencionado, assim que a corrida terminar, as proteínas começarão a fluir do gel. A adição do corante Coomassie nano protein fará com que a maioria das proteínas precipite, impedindo sua difusão. O corante permitirá sua visualização. Os géis podem ser corados por 4 horas ou durante a noite em temperatura ambiente em um agitador Gangorra MR-1 ou agitador orbital 3D sunflower. O gel será então transferido para a solução de remoção de manchas (substitua por uma solução nova conforme necessário) que removerá o excesso de corante do gel e permitirá a visualização das bandas de proteína azuis. Uma vez alcançado o aspecto desejado das bandas de proteína, o gel pode ser lavado várias vezes em água destilada e armazenado a 4oC por várias semanas, alternativamente pode ser seco e guardado para armazenamento de longo prazo.


Coloração de cobre

Enxágue brevemente o gel em água destilada (30 segundos) e transfira-o para o corante Cobre por 5 a 15 minutos. Lave o gel brevemente em água deionizada e observe o gel contra um fundo de campo escuro. As proteínas aparecerão como zonas claras em um fundo azul translúcido. O gel pode ser completamente descolorido por repetidas lavagens na solução de descoloração.
Equilibre o gel no tampão de transferência antes de prosseguir com o blotting.


Transferência (blotting)

A transferência pode ser feita em condições úmidas ou semi-secas dependendo do sistema de Blotting Cleaver Scientific utilizado.
A transferência semi-seca é mais rápida, porém a transferência úmida é geralmente menos propensa a falhas devido à secagem da membrana e é especialmente recomendada para proteínas maiores >100KDa.
Após terminar a eletroforese, remova a placa de vidro e transfira o gel para o tampão de transferência. Equilibre o gel entre 10-30min em temperatura ambiente em um agitador de acordo com protocolos específicos. O equilíbrio facilita a remoção de sais e detergentes do tampão de eletroforese. Os sais, se não forem removidos, podem aumentar a condutividade do tampão de transferência, resultando em aumento de calor durante a transferência. Além disso, o equilíbrio permite que o gel se ajuste ao seu tamanho final (o gel de acrilamida encolherá em tampão contendo metanol), melhorando assim a eficiência da transferência,
Ao mesmo tempo, corte a membrana do mesmo tamanho do gel e equilibre também no tampão de transferência. Os dois tipos de membrana mais utilizados para proteínas são a membrana de nitrocelulose e a membrana de PVDF. Se você estiver usando membrana de PVDF, lembre-se de que é essencial pré-molhar a membrana em metanol 100% antes de mergulhá-la no tampão de transferência.

As etapas acima são necessárias para transferência úmida ou semi-seca.

A principal diferença é a montagem do sistema Blotting.

Depois de montado, insira o cassete na célula de transferência certificando-se de que o lado preto do cassete esteja voltado para o lado preto da célula de transferência. Neste caso, o “sanduíche” é submerso no tampão de transferência ao qual é aplicado um campo elétrico (ou seja, 250mA por 1h. Sempre verifique os protocolos específicos). Como a corrente produzirá alto calor, sempre pré-resfrie o tampão de transferência e use o pacote de resfriamento fornecido com o kit.
O aparelho Western blot semi-seco deve ser montado da seguinte forma: começando pela placa de platina (ânodo) / Papel filtro / membrana / gel / Papel filtro / tampa do cátodo de aço inoxidável / tampa de segurança
Normalmente, os mini-géis são transferidos por 15-30 minutos a 10-15V. Nunca exceda 25V mesmo para géis grandes.


Visualização de proteína na membrana

Esta etapa pode ser omitida

É possível visualizar as proteínas na membrana para verificar se a transferência foi bem-sucedida usando Ponceau Red.
Lave a membrana brevemente em 1xTBS-Tween20 (TBS-T); alternativamente, o tampão baseado em PBS também pode ser usado durante todo o procedimento. Incubar a membrana em Ponceau Red por 5 minutos e depois enxaguar abundantemente em água até que as bandas de proteína estejam bem definidas.
A membrana pode ser completamente descolorida lavando várias vezes com 1x TBS-T. Se estiver usando membrana de PVDF, reative em metanol e depois lave em 1xTBS-T.


Etapa de bloqueio

O bloqueio da membrana evita a ligação de fundo não específica dos anticorpos primários e secundários à membrana.
Os tampões de bloqueio mais comumente usados são leite desnatado e BSA. O leite é mais barato, mas não é recomendado para o estudo de fosfoproteínas (o leite contém caseína que é uma fosfoproteína)
O tempo de bloqueio pode variar entre 2-3 horas à temperatura ambiente num agitador até 24 horas (o bloqueio durante a noite deve ser sempre feito a 4oC).


Incubação com anticorpo primário

Após o bloqueio a membrana deve ser lavada 3x por 10 minutos em TBS-T
O anticorpo primário deve ser diluído em tampão de bloqueio fresco na diluição recomendada e a membrana incubada à temperatura ambiente por 2 horas em um agitador (é possível incubar durante a noite a 4oC).


Incubação com anticorpo secundário

Antes da adição com anticorpo secundário, a membrana deve ser lavada 3x 10 minutos em TBS-T
O anticorpo secundário deve ser diluído em tampão de bloqueio na diluição recomendada. O tempo de incubação varia entre 1 a 2 horas em agitação à temperatura ambiente (nunca incube o anticorpo secundário durante a noite).
Lavar a membrana 3x 10 minutos em TBS-T e 1x em TBS (sem adição de Tween20)
Existem várias opções de visualização para Western Blotting de acordo com a molécula conjugada aos anticorpos específicos:


Detecção colorimétrica

Western blotting com detecção colorimétrica usa anticorpos secundários conjugados a uma enzima que catalisa a conversão de um substrato cromogênico que precipita na membrana para produzir bandas coloridas que podem ser observadas visualmente. Por exemplo, para anticorpos conjugados com ALP, geralmente é usado o kit de detecção BCIP/NBT.
A membrana é incubada com o substrato cromogênico até que o nível de sinal necessário seja desenvolvido, então o substrato é simplesmente lavado. Isso interrompe a reação enzimática e impede que o blot se core ainda mais.
A detecção colorimétrica é rápida e fácil e não requer um sistema especializado para geração de imagens; no entanto, não é possível remover e reexaminar a membrana, se necessário. Além disso, é possível aumentar a sensibilidade do sinal, prolongando a incubação, mas isso pode levar a um aumento do ruído de fundo que pode obscurecer o sinal da proteína de interesse. Portanto, este método é mais adequado para proteínas abundantes.

Detecção por fluorescência

A detecção fluorométrica requer o uso de anticorpos que foram marcados com um fluoróforo. Uma fonte de luz é usada para excitar o fluoróforo. A luz é emitida em um comprimento de onda maior do que aquele usado para excitação e é detectada com leitores especializados, como a série de sistemas de imagem chemiPRO. As vantagens de usar este método de detecção incluem:

- Uso de vários fluoróforos para detecção simultânea de várias proteínas-alvo.

- A detecção fluorescente oferece um método quantitativo mais preciso do que um baseado em enzima que depende de uma reação química.

- A maioria das moléculas fluorescentes oferece excelente estabilidade, permitindo que os blots sejam arquivados e refeitos posteriormente.


Detecção por quimioluminescência

Western blotting quimioluminescente é um método de detecção de proteínas altamente sensível. A ampla faixa dinâmica permite a detecção de analito em uma ampla faixa de concentração de proteína. A detecção por quimioluminescência ocorre quando um substrato é catalisado por uma enzima e produz luz como subproduto da reação química. Por exemplo, para a detecção de anticorpos conjugados com HPR, ECL são os substratos geralmente usados. A luz é então capturada usando uma câmera CCD refrigerada, como a encontrada em nossos sistemas chemiPRO e chemiLITE.
A resposta linear das enzimas repórter combinadas com substratos quimioluminescentes aprimorados torna o método de detecção adequado para ensaios quantitativos. O sinal decairá com a exaustão do substrato, embora a enzima permaneça ativa. O sinal pode ser atualizado adicionando um novo substrato, se necessário.

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